Kuvaus

Het lac operon is een genencluster van E.coli dat in afwezigheid van glucose de vergisting van lactose verzorgt. (zie Biology van Campbell, blz 445, figuur 20.4;). Het lac operon omvat een promoter, een operator en 3 genen: het lacZ, lacY en lacA gen. Het lacZ gen codeert voor b-galactosidase, het enzym dat lactose hydrolyseert tot glucose en galactose. Het lacZ gen hoeft alleen maar “aan” te staan indien er lactose aanwezig is i.p.v. glucose. In aanwezigheid van glucose zal daarom een repressoreiwit, het lacI eiwit, binden aan de operator zodat de promoter van het lac operon geblokkeerd wordt. Er wordt dan dus ook geen lacZ mRNA gemaakt. Indien er echter lactose in de cel komt, zal een kleine hoeveelheid hiervan worden omgezet in een isomere vorm, het allolactose. Dit allolactose bindt vervolgens aan het lacI eiwit waardoor het lacI eiwit loslaat van de operator. De promoter komt dus “vrij” en lacZ mRNA kan gesynthetiseerd worden. In een zogenaamde blauw-wit screening wordt het lac operon gebruikt om bij de klonering van een DNA fragment in pUC18 te bepalen welke kolonies daadwerkelijk het gewenste recombinant plasmide bevatten. Er wordt gewerkt met een gemuteerde E. coli stam (E.coli K12 deletiemutant) die géén chromosomaal lacI en lacZ gen meer heeft (bijv. E.coli PC2495). De pUC plasmiden bevatten zowel het lacI als het lacZ gen. Alleen wanneer pUC plasmiden gecombineerd worden met deze bacteriën zal er toch een functioneel lac operon ontstaan door complementatie van bacterie- en plasmide-gecodeerde genen. (Tijdens de theorie lessen Moleculaire Biologie zal deze zogenaamde alpha-complementatie en het betrokken F’plasmide gedetailleerd besproken worden. Van deze eigenschap wordt als volgt gebruik gemaakt: in het lacZ gen van pUC plasmiden is een multiple cloning site (MCS) gezet zonder het leesraam van het lac Z gen te verstoren. Een vreemd DNA fragment wordt vervolgens in de MCS gekloneerd, waardoor het open leesraam van het lac Z gen vernietigd wordt. Daardoor kan er geen funktioneel b-galactosidase meer gemaakt worden. Om nu een onderscheid te maken tussen bacteriën die een pUC plasmide dragen met een DNA insertie (recombinante plasmiden) en bacteriën die een "leeg" pUC plasmide dragen, worden de verkregen kolonies bekeken op b-galactosidase activiteit. De aanwezigheid van functioneel b-galactosidase in bacteriekolonies is simpel vast te stellen door aan de voedingsbodems isopropyl-b-thiogalactopyranoside (IPTG) en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactoside (X-gal) toe te voegen. IPTG werkt net als allolactose en induceert de vorming van lac Z mRNA (en dus b-galactosidase) door het wegvangen van het lac I eiwit van de lac operator. X-gal is (net als lactose) een substraat voor het gevormde b-galactosidase, dat de indolylgroep van het galactoside afsplitst, waardoor bacteriekolonies met functioneel b-galactosidase blauw kleuren. Bacteriekolonies die een recombinant pUC plasmide bezitten kunnen geen functioneel b-galactosidase vormen en blijven dus wit.

Malli

openjourney-v4